題目：基體剛度對(duì)梗死邊界機(jī)械耦合和力傳播的影響
（如果需要完整文獻(xiàn)請(qǐng)與我們工作人員聯(lián)系，可試樣）
簡(jiǎn)介：異質(zhì)細(xì)胞間耦合在心臟的機(jī)械和電信號(hào)傳輸中起著重要作用。盡管許多研究已經(jīng)研究了心肌組織內(nèi)肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞之間的電信號(hào)傳導(dǎo)，但研究機(jī)械對(duì)應(yīng)物的研究并不多。本研究旨在研究在健康和心臟病發(fā)作模擬基質(zhì)僵硬條件下，底物硬度和心肌成纖維細(xì)胞（CMF）的存在對(duì)心肌細(xì)胞（CMs）和CMFs機(jī)械力傳播的影響。使用集成了與 CMF 集成的生物納米壓痕儀測(cè)量了 CM 產(chǎn)生的收縮力及其在 CMF 中的傳播熒光顯微鏡用于快速鈣成像。我們的結(jié)果表明，較軟的基質(zhì)有助于更強(qiáng)和更進(jìn)一步的信號(hào)傳輸。有趣的是，CMF的存在以剛度依賴的方式衰減了信號(hào)傳播。與具有CMF的軟基質(zhì)相比，存在CMF的較硬基質(zhì)使信號(hào)衰減約24-32%，表明心肌梗死后基質(zhì)剛度增加和CMF數(shù)量增加對(duì)心肌功能具有協(xié)同不利影響。此外，CMF運(yùn)動(dòng)在CM-CMF邊界處的跳動(dòng)模式也取決于基板剛度，從而影響CM產(chǎn)生的收縮力的傳播波形。我們進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬，以進(jìn)一步了解不同力傳遞模式的發(fā)生，并表明在CM-CMF界面處組裝的細(xì)胞-基質(zhì)粘附（根據(jù)基板剛度而不同）在決定信號(hào)傳輸?shù)男屎蜋C(jī)制方面起著重要作用?？傊说孜飫偠韧?，受底物剛度影響的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的程度和類型也會(huì)影響心肌組織中肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞之間的機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)。
1.介紹
心肌梗塞（MI）是死亡的主要原因之一）。MI導(dǎo)致心肌中疤痕組織的形成，與健康組織相比，心肌具有不同的機(jī)械性能和細(xì)胞組成（）。具體來(lái)說(shuō)，梗死組織已經(jīng)顯示出更硬，測(cè)量的剛度為100-1000 kPa（，），而健康組織的硬度僅為～10-20 kPa（）。在健康的心臟組織中，心臟成纖維細(xì)胞（CFs）占心肌細(xì)胞的～45-75%，取決于物種（）。成年哺乳動(dòng)物心臟的再生能力有限。在像心肌梗死這樣的損傷后，丟失的心肌細(xì)胞（CM）被纖維化疤痕組織）所取代，該組織主要由損傷區(qū)域附近的CF形成。在此過(guò)程中，CF轉(zhuǎn)分化為心肌成纖維細(xì)胞（CMF），并構(gòu)成疤痕組織細(xì)胞群的重要組成部分。疤痕組織的形成觸發(fā)周圍心肌（重塑）。早期的研究表明，纖維化引起的僵硬增加可歸因于膠原細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過(guò)度積累和交聯(lián)）?？偟膩?lái)說(shuō)，CMF介導(dǎo)的纖維化組織形成，基質(zhì)硬度增加和CMF數(shù)量增加會(huì)損害心臟收縮力和功能。因此，更好地了解CM和CMF之間的結(jié)構(gòu)和功能相互作用以及機(jī)械微環(huán)境對(duì)這種相互作用的影響對(duì)于開(kāi)發(fā)新的心臟療法是必要的。
各種研究表明基質(zhì)硬度，外部機(jī)械刺激和CMF的存在對(duì)心臟收縮力（的影響）。ECM硬度的增加也被證明會(huì)影響CM分化和成熟。然而，大多數(shù)這些早期研究都集中在CMs和CFs之間關(guān)于底物剛度的電滲耦合或研究傳導(dǎo)速度的變化，以響應(yīng)非肌細(xì)胞（即CFs或CMF）群體的增加（）。除了電滲耦合，機(jī)械耦合在確定心肌細(xì)胞（信號(hào)傳播的效率方面也起著重要作用。然而，關(guān)于機(jī)械信號(hào)在CM-CMF邊界上的傳播以及基板剛度對(duì)機(jī)械傳播距離的影響的文獻(xiàn)仍然有限。最近的研究很少調(diào)查外部機(jī)械刺激對(duì)CMs（產(chǎn)生的收縮力的影響。盡管這些研究研究了機(jī)械微環(huán)境對(duì)CM收縮性和CM-CM耦合的影響，但據(jù)我們所知，這些研究都沒(méi)有研究CMF中收縮力傳播的大小和距離。
本研究通過(guò)CMs和CMFs在不同剛度基質(zhì)上的微模式共培養(yǎng)，模擬健康和梗死心肌，并研究了CM-CMF界面上CMF之間的機(jī)械信號(hào)傳播。為此，我們制造了具有14、83和484 kPa剛度的底物，以模擬健康（15 kPa）（6），1周（50-100 kPa））和2至周（200-1000 kPa）（）MI梗死后組織，分別使用生物相容性彈性聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）。為了研究CMF的存在對(duì)機(jī)械信號(hào)傳播的影響，我們?cè)谖D案襯底上接種了含有約30%CFs（23）的CM懸浮液混合物，并通過(guò)CFs的自增殖和分化為CMF形成CM-CMF邊界。 通過(guò)駐留測(cè)量在單細(xì)胞水平上測(cè)量CMs和CMF的收縮力（14， 24）使用生物納米壓痕（）。 這里使用的停留測(cè)量方法類似于用于測(cè)量細(xì)胞應(yīng)力松弛行為的技術(shù)（27）。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞壓痕到一定程度，并且壓痕探頭與細(xì)胞保持接觸30秒。跳動(dòng)引起的電池高度變化導(dǎo)致懸臂偏轉(zhuǎn)的變化，這對(duì)應(yīng)于電池沿橫向施加的收縮力。使用停留測(cè)量方法，我們已經(jīng)表明心肌的微環(huán)境特性，如基質(zhì)硬度和CMF的存在，在調(diào)節(jié)跨MI邊界的機(jī)械傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。研究了CMs和CMFs收縮力的大小和模式，闡明了梗死組織中機(jī)械信號(hào)傳播的機(jī)制。除了機(jī)械表征外，我們還對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞偶聯(lián)蛋白和粘附進(jìn)行了生化分析。CMF通過(guò)其應(yīng)激纖維中α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)來(lái)鑒定（）。最后，我們使用有限元分析（FEA）模型來(lái)理解和驗(yàn)證我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)CMF的存在會(huì)根據(jù)基板剛度衰減機(jī)械信號(hào)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CM-CMF界面處的細(xì)胞-基質(zhì)粘附分布控制著CM-CMF邊界處的跳動(dòng)波型。了解組織微環(huán)境對(duì)常駐心肌細(xì)胞的影響是改善心肌治療的關(guān)鍵一步。這項(xiàng)研究的結(jié)果對(duì)于理解CMF的存在和ECM硬度對(duì)健康和梗塞心臟的細(xì)胞相互作用和功能的影響可能很重要。
采用不同比例的堿/固化劑制備不同剛度的PDMS基底，研究基質(zhì)剛度對(duì)細(xì)胞功能和行為的影響。我們分別使用1：100、1：40和1：20堿/固化劑比例組合制備了三種不同的基材，其剛度約為14 kPa（軟）、83 kPa（中等）和484 kPa（剛性）。準(zhǔn)備好混合物后，將它們脫氣并倒在普通玻璃蓋玻片（直徑= 30 mm）上，以750 rpm旋轉(zhuǎn)30秒，然后烘烤。1：40和1：20 PDMS樣品分別在80°C下烘烤5和2 h，而1：100 PDMS樣品在95°C下烘烤13–14 h以固化。固化后，使用惰性硅膠將PDMS涂層玻璃基板粘合到35-mm培養(yǎng)皿上，以防止樣品在納米壓痕儀測(cè)量期間移動(dòng)，用等離子體放電處理1分鐘并浸入去離子水中直至基板功能化。
在本研究中，制備了以下兩組樣品：共培養(yǎng)樣品（即CM-CMF）和不含任何CMF的對(duì)照樣品（即單個(gè)CM培養(yǎng)物）。對(duì)于這兩種樣品，在細(xì)胞接種前用FN涂覆底物，以促進(jìn)細(xì)胞附著在PDMS底物上。將FN溶液（50 μ g/mL）以液滴形式置于底物中心，并將樣品在37°C下孵育1 h。蛋白質(zhì)孵育后，除去溶液，洗滌樣品并保持在PBS中直至細(xì)胞接種。在共培養(yǎng)樣品中，為了在基板上形成細(xì)胞附著的圖案，如前所述，使用厚度為100 μm的PDMS薄膜薄條在細(xì)胞接種期間部分阻斷細(xì)胞培養(yǎng)底物（圖1 A）。去除條帶后，CF細(xì)胞增殖，遷移并在涂層表面的另一半分化為CMF。對(duì)于對(duì)照樣品，我們將PDMS條帶放在基板上，然后用FN涂覆，并將其留在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中，以防止細(xì)胞遷移和基質(zhì)另一半的生長(zhǎng)。將PDMS條帶放置在FN包被之前有助于條帶更牢固地粘附在基材上，并防止在更換培養(yǎng)基期間出現(xiàn)任何脫落，直到我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)的第5天，即駐留測(cè)量之前剝離條帶。
使用Piuma Chiaro納米壓痕系統(tǒng)（Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）（26）測(cè)試天然心臟組織塊，具有不同剛度的PDMS底物以及PDMS底物上培養(yǎng)的CMF細(xì)胞的硬度。
使用直徑為90 μm的膠體探針測(cè)試具有不同剛度的PDMS基板。用于軟基板的壓痕探頭的彈簧常數(shù)為0.43 N/m，而用于中等和剛性基板的探頭的彈簧常數(shù)為4.21 N/m。針對(duì)每個(gè)PDMS底物條件測(cè)試了三個(gè)單獨(dú)的樣品，并從每個(gè)樣品的不同位置記錄了多個(gè)測(cè)量值。所有樣品共記錄了204-390個(gè)壓痕數(shù)據(jù)點(diǎn)。
用于在PDMS襯底上接種的CMF的壓痕探頭的彈簧常數(shù)和直徑分別約為0.045 N / m和41 μm。針對(duì)每種底物類型，在兩個(gè)獨(dú)立樣品上總共測(cè)試了45種不同的CMF細(xì)胞。在測(cè)試之前，懸臂的靈敏度校準(zhǔn)是通過(guò)壓痕硬表面（即載玻片）進(jìn)行的。使用的加載速度分別為 50、2 和 0.2 μm/s。開(kāi)發(fā)了一個(gè)定制的MATLAB代碼（The MathWorks，Natick，MA），以確定探針和樣品之間的接觸點(diǎn)，并使用赫茲接觸模型（27，33）識(shí)別樣品的楊氏模量：
其中F是施加的力，δ是壓痕深度，R是膠體探針的半徑，E是樣品的楊氏模量。假設(shè)樣品是不可壓縮的（即泊松比為0.5），因?yàn)槭褂迷撃Ｐ偷奈墨I(xiàn)研究得出的結(jié)論是，當(dāng)泊松比從0.3到0.5變化時(shí)，測(cè)量的性質(zhì)變化小于20%，因此，假設(shè)大多數(shù)生物樣品的不可壓縮性是合理的).使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以95%置信水平報(bào)告統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。
通過(guò)駐留實(shí)驗(yàn)用納米壓痕儀測(cè)量細(xì)胞片內(nèi)單個(gè)CM和CMF的收縮力。簡(jiǎn)而言之，將納米壓痕探針與樣品接觸，并且探針的位移保持恒定（換句話說(shuō)，探針駐留在樣品上）30秒以動(dòng)態(tài)測(cè)量其偏轉(zhuǎn)，這與電池沿橫向相對(duì)于基板的收縮力成正比。
首先，我們測(cè)量了共培養(yǎng)樣品上與CM-CMF邊界相鄰的單個(gè)CM的收縮力，以及沒(méi)有任何CMF的對(duì)照樣品上CM-PDMS邊界處的CM。然后，依次測(cè)量單個(gè)CMF的收縮力，每次在距邊界更遠(yuǎn)的距離處測(cè)量，如圖 A所示，直到?jīng)]有可檢測(cè)到的信號(hào)。所有跳動(dòng)力測(cè)量均在細(xì)胞核上進(jìn)行，以確保一致性，并盡量減少細(xì)胞剛度異質(zhì)性的影響。每次測(cè)量后，懸臂沿X軸移動(dòng)，并在最近的CMF上進(jìn)行測(cè)量。因此，所有測(cè)量都是在距邊界相似的距離處進(jìn)行的，根據(jù)最近CMF的確切位置，差異僅為～5-10%。所用探頭的彈簧常數(shù)和直徑分別為0.067 N/m和5.4 μm。開(kāi)發(fā)了定制的 MATLAB 代碼來(lái)分離每個(gè)單拍并計(jì)算平均收縮力。
為了開(kāi)發(fā)本研究中的FEA模型，通過(guò)圖像分析和納米壓痕測(cè)量測(cè)量了CMF的尺寸（即細(xì)胞直徑和高度）。首先，我們通過(guò)測(cè)量新附著的球形CMF的直徑和高度來(lái)計(jì)算單個(gè)CMF的體積，該CMF在細(xì)胞接種后不超過(guò)15分鐘接種在培養(yǎng)皿上，以確保細(xì)胞仍呈球形。簡(jiǎn)而言之，捕獲了這些球形細(xì)胞的明場(chǎng)圖像，并通過(guò)使用ImageJ繪制兩條從細(xì)胞中心穿過(guò)的對(duì)角線來(lái)測(cè)量直徑，以獲得D0.然后，這些球形細(xì)胞的高度，H0，通過(guò)使用納米壓痕儀壓進(jìn)細(xì)胞及其旁邊的基板并記錄細(xì)胞-基底接觸點(diǎn)（）來(lái)測(cè)量。這些尺寸用于計(jì)算細(xì)胞的體積V0如下：
最后，我們測(cè)量了在不同剛度基材上播種并鋪展的CMF的高度。由于擴(kuò)散的CMF的不規(guī)則形狀，我們假設(shè)細(xì)胞體積被保留，而不管細(xì)胞的形狀調(diào)制，同時(shí)擴(kuò)散（）?；谶@一假設(shè)并使用第V卷0并測(cè)量了不同剛度基板上展開(kāi)的CMF的CMF高度H，我們使用以下公式計(jì)算了不同PDMS基板上CMF的直徑D：
首先，我們通過(guò)納米壓痕實(shí)驗(yàn)研究了天然組織基質(zhì)、具有不同剛度的制備PDMS底物以及在這些基質(zhì)上接種的CMFs的粘彈性。我們觀察到不同PDMS基板的測(cè)量剛度的變化取決于壓痕的加載速度。PDMS基板剛度是在三種不同的加載速度（即50、2和0.2 μm/s）下測(cè)量的，如圖B所示。當(dāng)加載速度從50 m/s降低到2 μ m/s和從2 μm/s（p < 0.0001）降低時(shí)，基體的剛度顯著降低，但軟基體的剛度從50 m/s降低到2 μm/s（p = 0.1484）時(shí)除外。同樣，在不同PDMS襯底上晶種的CMF表現(xiàn)出加載速度依賴性剛度（p < 0.005），但當(dāng)加載速度從2 m/s降低到0.2 μ m/s（p = 0.1924）時(shí)，在中等襯底上接種的CMF除外（C）。為了進(jìn)行比較，測(cè)量了天然大鼠心臟組織的硬度，該硬度也隨著加載速度從50降低到0.2 μm / s（p < 0.05）而降低。
PDMS襯底和在PDMS襯底上晶種的CMF均表現(xiàn)出應(yīng)變速率依賴性剛度。軟底物剛度約為13.9-17.66 kPa，與天然健康心臟組織的硬度相似（即11.33-18.46 kPa （）），因?yàn)槲覀儨y(cè)量的健康成年大鼠心臟為13.32±8.60 kPa，而中度和僵硬底物的硬度分別為83.29-105.71和483.92-529.63 kPa，與早期研究中測(cè)量的梗死心臟組織的硬度相當(dāng)（）. 同樣，在軟、中和硬基底上接種的 CMF 的剛度分別為 0.95–3.02、2.06–4.96 和 1.61–5.47 kPa?？梢钥闯觯珙A(yù)期的那樣，電池剛度隨著基板剛度的增加而增加（）。這種加載速度依賴性剛度與先前在組織和細(xì)胞（上的發(fā)現(xiàn)一致）。
為了區(qū)分共培養(yǎng)樣品中的CM和CMF并正確識(shí)別CM-CMF邊界，用Ca對(duì)樣品進(jìn)行染色2+染。來(lái)自CA的代表截圖2+硬質(zhì)基板樣品上的通量視頻（）如圖所示。因?yàn)橹挥?CM 表現(xiàn)出 Ca（鈣）2+通量，用于在活細(xì)胞測(cè)量期間實(shí)時(shí)區(qū)分兩種細(xì)胞類型（圖2 A）。我們還開(kāi)發(fā)了一個(gè)定制的 MATLAB 代碼來(lái)測(cè)量這些鈣的瞬時(shí)持續(xù)時(shí)間2+助焊劑視頻。對(duì)于接種在軟、中和硬基質(zhì)上的CMs，結(jié)果分別為1.00 ± 0.59、1.17 ± 0.49和2.10 ± 0.37 s。基于Ca的代表性CT曲線2+在不同剛度基板上培養(yǎng)的CM的成像如圖2D所示。
在這項(xiàng)工作中，我們研究了機(jī)械微環(huán)境對(duì)肌細(xì)胞（即CMs）在非肌細(xì)胞（即CMF）上的機(jī)械信號(hào)傳播的影響。我們研究了機(jī)械耦合以及CM和CMF之間的相互作用在健康和梗死組織模型中的關(guān)鍵作用。據(jù)我們所知，我們的研究測(cè)量和表征了CM和CMF的收縮力，CM-CMF邊界處的力傳遞及其對(duì)基體剛度的依賴性。我們已經(jīng)證明，較軟的基板有助于更強(qiáng)的收縮和機(jī)械信號(hào)的傳輸。此外，我們發(fā)現(xiàn)CMF的跳動(dòng)模式取決于基質(zhì)剛度，在機(jī)械信號(hào)傳輸中起著重要作用，這是一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)，可能有助于闡明梗死組織硬度和大小對(duì)心律失常的影響。我們還確定了粘附的剛度依賴性分布對(duì)機(jī)械信號(hào)傳輸?shù)淖饔?。該?xiàng)目的結(jié)果將幫助我們更好地了解疤痕組織的影響，這將有助于探索梗塞和心律失常等心肌病的新療法。
Optics11結(jié)合*Piuma技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)出了結(jié)構(gòu)緊湊靈活的PIUMA Chiaro。這種納米壓痕模塊可以放置在任何顯微鏡，允許在最小的樣品或者特征上進(jìn)行非常精確的壓痕實(shí)驗(yàn)。單細(xì)胞壓痕實(shí)驗(yàn)終于被變得非常簡(jiǎn)單了！該系統(tǒng)在液體中表現(xiàn)特別好。只要插入探頭就可以開(kāi)始?jí)汉蹨y(cè)試！Chiaro人體組織和軟材料的機(jī)械性能Chiaro人體組織和軟材料的機(jī)械性能
Chiaro細(xì)胞壓痕儀
Piuma Chiaro和Piuma獨(dú)立機(jī)型使用同樣的技術(shù)以及硬件。這意味著兩者的掃描頭部可以互換，在保持其他所有硬件和軟件不變的情況下。 Piuma 納米壓痕技術(shù)包括了一個(gè)非常敏感的探測(cè)壓頭，一個(gè)可以粗進(jìn)以及精進(jìn)的移動(dòng)臺(tái)，通過(guò)它可以實(shí)現(xiàn)樣品的自動(dòng)逼近以及非常精確的壓痕。壓頭可以在X-Y方向移動(dòng),允許在單個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行精密的點(diǎn)陣壓痕來(lái)測(cè)量楊氏模量。Piuma Chiaro可以和任何類型顯微鏡結(jié)合使用！
楊氏模量
10 Pa – 1 GPa
可重復(fù)性
<1%
壓頭尺寸
100 nm to 100's µm
最大壓痕深度
20 µm
壓痕動(dòng)態(tài)帶寬
~ DC 100 Hz (continuous)
力學(xué)分辨率
0.1 nN
機(jī)械臂移動(dòng)范圍
12 x 12 x 12 mm2
M最小點(diǎn)陣間距
<1 µm
點(diǎn)陣壓痕速度
Up to 1 point / s
